Klasyfikacja tkanek - mikroskopia FT-IR i uczenie maszynowe
Obrazowanie chemiczne może posłużyć za dodatkowe narzędzie diagnostyczne w zastosowaniach klinicznych takich jak diagnoza raka. Szczególnie interesująca jest możliwość automatyzacji procesu klasyfikacji elementów biopsji. Na poniższym obrazku przedstawiono predykcję na macierz biopsji igłowych tkanki przełyku wyników cross-walidacji z użyciem klasyfikatora typu random forest.
Rysunek 1. Predykcja na macierz biopsji przełyku: dojrzały nabłonek, nabłonek zmieniony rakowa oraz inne elementy tkankowe. Macierz została zmierzona w trybie transmisji. Wygenerowane dzięki klasyfikatorowi obrazy biopsji zgadzają się ze zdjęciami spod mikroskopu optycznego wybarwionych biopsji (H&E) . Link do źródła.
Orientacja makromolekuł w biopsji w przestrzeni dwuwymiarowej
Polaryzacja liniowa oraz kołowa promieniowania podczerwonego dostarcza nam kolejnego rodzaju informacji, obok obrazu oraz informacji chemicznej, jest to uporządkowanie w materiale – zarówno jego stopień jak i organizacja molekuł.
Połączenie zaawansowanych metod obrazowania oraz polaryzacji liniowej światła pozwalają na wyznaczenie orientacji makromolekuł w przestrzeni dwu-, a nawet trójwymiarowej. Rozwinięciem używanej w materiałoznawstwie metody z użyciem dwóch prostopadłych polaryzacji, jest zastosowanie czterech, co pozwala na dopasowanie funkcji sinusoidalnej i precyzyjne wyznaczenie kierunku oscylacji.
Rysunek 2. Obrazy wygenerowane dla intensywności pasma amidu II z użyciem czterech różnych kątów polaryzacji (a), teoretyczne ujęcie zależności absorbancji od kąta polaryzacji liniowej (b), funkcja Hermansa (stopień uporządkowania) dla amidu III, widma spektralne obszaru o dużym i małym stopniu uporządkowania (d).
Metodę „czterech polaryzacji” nasz zespół wykorzystał do wyznaczenia kierunku włókien kolagenowych w biopsjach w mikrośrodowisku raka oraz stopnia uporządkowania struktury (tzw. funkcja Hermansa).
Rysunek 3. Zdjęcie spod mikroskopu optycznego wybarwionej biopsji igłowej trzustki (H&E) oraz orientacje obliczone dla trzech pasm amidowych (drganie amidu II i III jest równoległe do głównego łańcucha kolagenu, a amidu I prostopadłe). Link do źródła pierwszego. Link do źródła drugiego.
Orientacja makromolekuł w polimerze w przestrzeni trójwymiarowej
Jednoczesna analiza dwóch pasm absorpcyjnych, którym odpowiadają oscylacje o prostopadłych kierunkach względem siebie, pozwala na wyznaczenie orientacji molekuł w przestrzeni trójwymiarowej z użyciem czterech kątów polaryzacji. Sam układ pomiarowy nie ulega zmianie, jak przedstawiono na poniższym rysunku. Wciąż jest to układ dwóch polaryzatorów w przypadku pomiarów w trybie transmisji i jednego polaryzatora, gdy próbka mierzona jest w trybie transfleksji lub refleksji. Rozszerzeniu ulega podejście matematyczne do zagadnienia wyznaczenia orientacji molekuł w przestrzeni 3D.
Rysunek 4. Układ mikroskopowy do mierzenia próbki z użyciem czterech różnych polaryzatorów (a), teoretyczne przedstawienie zagadnienia (b-e).
Nasz zespół jako pierwszy na świecie zastosował technikę jednoczesnej analizy orientacji dwóch pasm w praktyce, uzyskując w ten sposób informację o przestrzennej budowie sferulitu (skrystalizowanej formy) polimeru, dokładnie biodegradowalnego polikaprolaktonu (PCL).
Rysunek 5. Wyniki obliczeń orientacji 3D pierwszego momentu przejścia, równoległego do głównej osi molekuły (a) polimeru oraz drugiego, prostopadłego (b). Wyniki pomiarów dla mikroskopii FT-IR oraz O-PTIR. Link do żródła
Jednoczesne spektroskopia O-PTIR i Ramana
Jak przedstawiono powyżej metoda czterech polaryzacji może być z sukcesem wykorzystana w mikroskopii O-PTIR, co pozwala na uzyskanie wyników z kilkukrotnie większą rozdzielczością przestrzenną.
Metoda O-PTIR oprócz uzyskania obrazu i widma z rozdzielczością przestrzenną w zakresie kilkuset nanometrów pozwala również na jednoczesne uzyskanie widma IR oraz Ramana dzięki zastosowaniu w konstrukcji zielonego lasera 532 nm. Fizyczne podstawy spektroskopii FT-IR i Ramana są zupełnie różne, dzięki czemu stanowią dwie komplementarne metody, które wspólnie pozwalają na uzyskanie znacznie głębszej i kompletniejszej informacji o materiale niż osobno. Spektroskopia Ramana wykorzystuje zjawisko nieelastycznego rozpraszania światła. Fotony ze źródła monochromatycznego padające na próbkę wzbudzają cząsteczki do wirtualnych stanów energetycznych, a następnie są rozpraszane z wyższą lub niższą energią do wyjściowej. To tzw. przesunięcie ramanowskie jest zależne od chemiczne struktury próbki.
W badaniach biologicznych mikroskopia O-PTIR może posłużyć do badań „masy” lub pojedynczych komórek np. bakteryjnych. W połączeniu z analizą chemometryczną uzyskanych widm z powodzeniem może być użyta do identyfikacji mikroorganizmów.
Rysunek 6. Wyniki PCA (analiza głównych składowych) widm O-PTIR oraz Ramana dwunastu różnych typów bakterii wywołujących u ludzi infekcje. Link do źródła.Mikroskopia O-PTIR w badaniach zabytków i sztuki
Kolejną z zalet różnych rodzajów mikroskopii IR jest niewielka ilość próbki potrzebnej do uzyskania widm wysokiej jakości i jej pełnej charakterystyki. Ma to szczególne znaczenie m.in. w badaniach dziedzictwa kulturowego np. obrazów.
W badanich 2021 roku wykorzystano niespełna milimetrowy skrawek pobrany z obrazu van Gogha „Artezjanka”. Obrazowanie O-PTIR pozwoliło na stworzenie map związków wykorzystanych przez artystę do wykonania obrazów oraz identyfikację różowego pigmentu.
Rysunek 7. Analiza O-PTIR (mapy integracji i przykładowe widma) przekroju próbki oraz charakterystyka różowego pigmentu. Link do źródła.
Struktura drugorzędowa białek
Struktura wielu materiałów jest uporządkowana na przynajmniej kilku stopniach – jest to tzw. budowa hierarchiczna. Spolaryzowana liniowo mikroskopia FT-IR pozwoliła naszemu zespołowi na identyfikację oraz wyznaczenie orientacji i stopnia uporządkowania włókien kolagenowych, których średnica wynosi kilka lub kilkanaście mikrometrów. Pojedynczy łańcuch kolagenowy zbudowany jest z powtarzających się sekwencji aminokwasów. Skręcone łańcuchy mogą przyjąć różne formy przestrzenne, w śród nich jest m.in. α-helisa i β-harmonijka. Molekuły upakowane są w fibryle o średnicy kilkuset nanometrów, a te tworzą włókna. Właściwości białek, funkcje i rodzaj interakcji nie zależą jedynie od ich składu chemicznego, ale również architektury.
Rysunek 8. Budowa hierarchiczna włókna kolagenowego.
Mikroskopia AFM-IR pozwala na uzyskanie sygnału IR od pojedynczego białka oraz określenie jego struktury drugorzędowej na podstawie charakteru pasma amidu I, na które w 80% składają się drgania rozciągające od grupy karbonylowej (C=O).
Rysunek 9. Określenie struktury drugorzędowej białek (ferrytyna i tyreoglobulina) z użyciem pojedynczej molekuły. Link do źródła.
Badanie nadstruktur polimerowych
Rozdzielczość przestrzenna s-SNOM zależy w głównym stopniu od średnicy igły. Badania z 2021 roku pokazały, że za pomocą s-SNOM i AFM-IR jest możliwe odróżnienie od siebie trzech nanowarstw w polimerowych nanomateriałach typu core-shell, co nie udało się przy użyciu mikroskopii TEM, która nie dostarcza informacji chemicznej.
Rysunek 10. Badania przekrojów różnych nanocząstek polimerowych o budowie warstwowej. Dla każdej cząsteczki zmierzono po trzy widma dla trzech warstw: core, inner shell i outer shell. Link do źródła.
Danuta Liberda, Michael Hermes, Paulina Koziol, Nick Stone, Tomasz P. Wrobel
Journal of Biophotonics 2020, DOI:10.1002/jbio.202000122
Paulina Koziol, Danuta Liberda, Wojciech M. Kwiatek, Tomasz P. Wrobel
Analytical Chemistry 2021, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02591
Karolina Kosowska, Paulina Koziol, Danuta Liberda, Tomasz P. Wróbel.
Clin. Spectroscopy 2021, 3, 100013, December 2021, DOI: 10.1016/j.clispe.2021.100013
Paulina Koziol, Karolina Kosowska, Danuta Liberda, Ferenc Borondics, Tomasz P. Wrobel
J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 31, 14278–14287, DOI: 10.1021/jacs.2c05306
Cassio Lima, Shwan Ahmed, Yun Xu, Howbeer Muhamadali, Christopher Parry, Rachel J. McGalliard, Enitan D. Carrol and Royston Goodacre
Chem. Sci., 2022,13, 8171-8179, DOI: 10.1039/D2SC02493D
Victoria Beltran, Andrea Marchetti, Gert Nuyts, Margje Leeuwestein, Christophe Sandt, Ferenc Borondics, Prof. Karolien De Wael
Angew. Chem., 2021, Issue 42, Volume 133, 22935-22942, DOI: 10.1002/ange.202106058
Francesco Simone Ruggeri, Benedetta Mannini, Roman Schmid, Michele Vendruscolo, Tuomas P. J. Knowles
Nat. Commun., 2020, 11, 2945, DOI: 10.1038/s41467-020-16728-1
Monika Goikoetxea, Iban Amenabar, Stefano Chimenti, Maria Paulis, Jose Ramon Leiza, and Rainer Hillenbrand
Macromolecules 2021, 54, 2, 995–1005, DOI: 10.1021/acs.macromol.0c02287