Rysunek 2. Metoda transmisji

W trybie refleksji próbki światło wychodzi z obiektywu jest skupiane na powierzchni próbki, ulega częściowej absorbcji, a odbita część wraca do obiektywu i jest kierowana do detektora (rysunek 3). W tej metodzie tylko połowa obiektywu jest oświetlana, druga połowa jest wykorzystywana do zbierania sygnału. Widma odbiciowe różnią się od klasycznych widm transmisyjnych ze względu na złożoność zjawisk absorpcji i obicia promieniowania, dotyczy to kształtu, względnej intensywności pasm i odwrócenia pasm, co przekłada się na zmieniony kształt widma. Otrzymane widma wymagają transformacji matematycznej t.j. transformacja Kramersa-Kroniga.

Rysunek 3. Metoda refleksji

Modyfikacją trybu refleksji jest metoda transfleksji. Wiązka wychodząca z obiektywu przechodzi przez cienką próbkę i odbija się od substratu pokrytego warstwą refleksyjną, na którym jest skupiona (rysunek 4). W tym przypadku wiązka dwukrotnie przechodzi próbkę. Metoda stosowana jest dla cienkich próbek.

Rysunek 4. Metoda transfleksji

Tryb ATR wykorzystuje zjawisko osłabionego całkowitego wewnętrznego odbicia do pomiarów w kontakcie próbki ze stożkowym, ostro zakończonym kryształem germanowym w obiektywie ATR (rysunek 5). Siła docisku kryształu do próbki to od 0.5 do 8 N. W wyniku interferencji fali padającej i fali odbitej tworzy się fala stojąca, która rozchodzi się w kierunku prostopadłym do granicy ośrodków tzw. fala zanikająca. Ponieważ głębokość penetracji zależy od długości fali promieniowania padającego, potrzebna jest korekta intensywności otrzymanego sygnału. Głębokość penetracji nie przekracza kilku mikrometrów w głąb próbki. 

Rysunek 5. Metoda ATR

Obrotowa apertura posiada 12 otworów o różnych średnicach od 0.3 do 3.75 mm. W zależności od powiększenia obiektywu wielkość mierzonego obszaru będzie inna (przykładowe średnice w tabeli 1).

Tabela 1. Przykładowe średnice apertury i średnice mierzonego obszaru różnymi obiektywami

Rysunek 7. Obrazowanie tkanki trzustki z wykorzystaniem rożnych obiektywów. Źródło: https://doi.org/10.1016/j.saa.2025.125769

W tabeli 2 zebrano podsumowanie metod pomiarowych dostępnych na stacji badawczej. Wielkość obiektywu należy dobrać na podstawie morfologii próbki. 

Tabela 2. Metody pomiarowe na mikroskopie FT-IR

Metoda analizy	Powiększenie obiektywu	Apertura numeryczna	Wielkość piksela [μm]	Odległość od próbki [mm]	Rozdzielczość przestrzenna [μm] dla 1000 cm-1	Detektor	Zakres spektralny
Obrazowanie
Transmisja	3.5x	0.15	11.4	duża	~41	FPA 64x64	4500-900  cm-1
	15x	0.40	2.7	24.0	~15
	20x	0.70	2.0	14.0	~9
	36x	0.52	1.1	10.4	~12
	40x	0.78	1.0	8.3	~8
	100x	0.80	0.4	1.8	~7.7
Transfleksja	3,5x	0.15	11.4	duża	~41
	15x	0.40	2.7	24.0	~15
	20x	0.70	2.0	14.0	~9
	36x	0.52	1.1	10.4	~12
	40x	0.78	1.0	8.3	~8
	100x	0.80	0.4	1.8	~7.5
ATR	20x	0.60	2.0	w kontakcie	~10	FPA 64x64	4500-900  cm-1
Mapowanie
Transmisja	3.5x	0.15		duża	~41	MCT 250 μm	5000-415 cm-1
	15x	0.40		24.0	~15
	20x	0.70		14.0	~9
	36x	0.52		10.4	~12
	40x	0.78		8.3	~8
	100x	0.80		1.8	~7,5
Transfleksja	3.5x	0.15		duża	~41	MCT 250 μm	5000-415 cm-1
	15x	0.40		24.0	~15
	20x	0.70		14.0	~9
	36x	0.52		10.4	~12
	40x	0.78		8.3	~8
	100x	0.80		1.8	~7.7
ATR	20x	0.60		w kontakcie	~10	MCT 250 μm	5000-415 cm-1

 

Standardowy detektor MCT 1 mm dedykowany do pomiarów ze źródłem Globar posiada zakres 12000-600 cm^-1, z rozdzielaczem wiązki KBr 8000-350 cm^-1.

4. Wymagania dla próbek

 

Wymagania dla próbek zebrano w tabeli 3.

 

	Transmisja	Refleksja	Transfleksja	ART
Grubość	5-30 μm	<10 mm	<15 μm	<10 mm
Chropowatość	-	<1 μm	<1 μm dla obrazowania	<5 μm
Jednolitość powierzchni	Wysoka dla obrazowania FPA	Wysoka dla obrazowania FPA	Wysoka dla obrazowania FPA	Wysoka dla obrazowania FPA
Substrat	Przeźroczysty dla IR	-	Odblaskowy dla IR (złoto lub inny metal)	-
Maksymalne wymiary (w x l x t)     z substratem	25 x 40 x 10 mm	25 x 40 x 10 mm	Odblaskowy dla IR (złoto lub inny metal)	25 x 40 x 10 mm

 

 

Drugą ze stacji końcowych linii CIRI jest mikroskop neaSCOPE (neaspec GmbH, Niemcy – obecnie część attocube systems AG, Niemcy). Mikroskop łączy mikroskopię sił atomowych (z ang. AFM) oraz spektroskopię w podczerwieni (z ang. IR). Pomiary na tym mikroskopie można wykonywać z nanometryczną rozdzielczością przestrzenną poniżej limitu dyfrakcji dla promieniowania IR. W zależności od potrzeb oraz właściwości próbki, możliwe jest użycie technik opartych na dwóch zjawiskach, tj. rozpraszania światła w bliskim polu (s-SNOM, nano-FTIR) oraz ekspansji termicznej (AFM-IR). Technika s-SNOM oparta jest o asymetryczny interferometr, gdzie sonda AFM oraz próbka znajdują się na jednym z ramion interferometru. Światło rozproszone z ramienia zawierającego próbkę jest łączone z wiązką referencyjną w pozycji detektora. Interferometryczna detekcja światła oparta na zmieniającej się pozycji lustra referencyjnego, a więc i fazie światła, pozwala na jednoczesny pomiar amplitudy i fazy światła rozproszonego pod sondą AFM, które związane są odpowiednio z lokalnymi własnościami refleksyjnymi oraz absorpcyjnymi próbki. Modulowanie fazą wiązki referencyjnej, a tym samym sygnałem na detektorze, pozwala na całkowite odseparowanie tła. Oznacza to, że technika s-SNOM dostarcza optyczne i chemiczne obrazy bliskiego pola pozbawione mechanicznych artefaktów. Sygnały optyczne zbierane są w tej technice równocześnie z topografią AFM oraz mechaniczną fazą. Typowym źródłem promieniowania IR w technice s-SNOM jest kwantowy laser kaskadowy (z ang. QCL). Spektroskopia nano-FTIR jest odmianą techniki s-SNOM, w której wąsko emisyjne źródło promieniowania IR zastąpione jest źródłem szerokopasmowym, np. wiązką synchrotronową lub laserem generującym mieszane częstości (z ang. DFG). Ta modyfikacja umożliwia obrazowanie hiperspektralne (tzn. pomiar całego widma IR w każdym pikselu skanowanego obszaru) z nanometryczną zdolnością rozdzielczą ograniczoną jedynie wielkością wierzchołka sondy AFM. Ostatnia z technik dostępnych w mikroskopie neaSCOPE, tj. technika AFM-IR, wykorzystuje zjawisko ekspansji termicznej próbki oświetlonej promieniowaniem IR. Zjawisko to powoduje zwiększenie się objętości próbki w wyniku absorpcji promieniowania IR. Rozszerzenie się objętości próbki jest rejestrowane przez sondę AFM, której amplituda wychylenia wzrasta w wyniku mechanicznego oddziaływania z rozszerzoną próbką. Ta metoda jest dedykowana do materiałów miękkich, które charakteryzują się większym współczynnikiem rozszerzalności termicznej. 
Podsumowanie wszystkich technik dostępnych na stacji końcowej s-SNOM/AFM-IR jest przedstawione w poniższej tabeli:

Zjawisko	Rozpraszanie bliskiego pola		Ekspansja termiczna
Ilustracja
Technika	obrazowanie s-SNOM	spektroskopia nano-FTIR	AFM-IR (tryb kontaktowy)	AFM-IR (tryb przerywanego kontaktu)
Rodzaj pomiarów	obrazowanie	spektroskopia	obrazowanie oraz spektroskopia
Rodzaj trybu AFM	przerywany kontakt		kontakt	przerywany kontakt
Źródło promieniowania IR	QCL	synchrotron	QCL (wkrótce również synchrotron)
Rodzaj emisji źródła promieniowania	wiązka ciągła		wiązka pulsacyjna (kHz)
Rodzaj detekcji	pseudoheterodyna (PH)	asymetryczna interferometria	wychylenie sondy AFM
Rodzaj detektora	detektor MCT chłodzony LN2		sonda AFM
Zakres spektralny [cm-1]	925 - 1725	550 - 3200	890 - 1779
Rozdzielczość spektralna [cm-1]	1	≥ 6,25	1
Wymagania wobec próbki	nanoobiekty lub cienkie filmy o dużej jednorodności powierzchni (zalecane < 200 nm) adsorbujące promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie środkowej podczerwieni oraz trwale związane z płaskim substratem (zalecana chropowatość < 2 nm) – kompatybilne z AFM
Rodzaj substratu	krzem, złoto	złoto, krzem	krzem, złoto, mika*
Minimalna grubość próbki	ok. 5 nm.		dziesiątki nanometrów
Wymiary próbki z substratem (szer. x dług. x wys.) [mm]	maks. 40 x 40 x 10 (zalecane: 10 x 10 x 1)
Głębokość zbierania sygnału	dziesiątki nanometrów		ok. 1 mikrometr
Środowisko pomiarowe	próbki stałe w atmosferze powietrza (temperatura pokojowa oraz ciśnienie standardowe)

Mikroskop O-PTIR jest trzecią stacją końcową linii pomiarowej CIRI. Jest to druga już technika opracowana w ostatnich latach do pomiarów obrazów w podczerwieni (IR) z rozdzielczością przestrzenną poniżej granicy dyfrakcji światła podczerwonego. Mikroskop posiada dwa źródła światła – laser sondujący (ang. probe) o długości fali w zakresie widzialnym (532 i 785 nm dostępne na linii pomiarowej CIRI) oraz źródło promieniowania podczerwonego – impulsowy, przestrajalny laser QCL lub źródło synchrotronowe o szerokim zakresie długości fal. Podczas eksperymentu próbka jest jednocześnie oświetlana skupionymi w jednym miejscu na próbce wiązkami światłem lasera widzialnego i podczerwonego. Gdy częstotliwość fali IR pokrywa się z częstotliwością drgań cząsteczek, następuje absorpcja, która prowadzi do ekspansji fototermicznej i związanego z tym zjawiskiem zmniejszenia współczynnika refrakcji w oświetlonym obszarze próbki. W rezultacie zmienia się natężenie i rozkład kątowy światła widzialnego odbitego, rozproszonego i/lub transmitowanego przez próbkę. Uzyskany sygnał jest wykorzystywany do generowania widma w podczerwieni. Siła zjawiska fototermicznego zależy parametrów związanych z próbką, między innymi od przewodności i pojemności cieplnej, gęstości cząsteczek absorbujących, a także od mocy lasera sondującego i mocy źródła światła podczerwonego. Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona jedynie długością fali lasera pełniącego rolę sondy. Oprócz elastycznego rozpraszania fotonów, które jest wykorzystywane do detekcji absorpcji w podczerwieni, jednocześnie zachodzi rozpraszania ramanowskiego, czyli powstawanie w zjawisku rozproszenia fotonów o zmienionej energii w stosunku do fotonów światła padającego na próbkę. W efekcie pasma stokesowskie i antystokesowskie pojawiają się w widmach symetrycznie po obu stronach od pasma pochodzącego z rozpraszania Rayleigha. Dostępny na linii CIRI mikroskop O-PTIR pozwala, dzięki zastosowaniu lasera widzialnego, na jednoczesne uzyskanie widm w podczerwieni i ramanowskich.

Szczegółowy opis mikroskopii O-PTIR wraz z wymaganiami i przykładami jest dostępny w artykule o otwartym dostępie tutaj: https://pubs.aip.org/aip/app/article/9/9/091101/3312368/A-tutorial-on-optical-photothermal-infrared-O-PTIR

Grafika 1. Uproszczona zasada działania mikroskopii O-PTIR w trybie co-prop. Do wykrywania absorpcji promieniowania podczerwonego wykorzystuje się promieniowanie widzialne, co pozwala na znaczną poprawę rozdzielczości przestrzennej.

Konfiguracje pomiarowe

W mikroskopie O-PTIR próbka może być oświetlana światłem podczerwonym od góry przez obiektyw refleksyjny Cassegrain lub od dołu przez układ optyczny z zwierciadłem parabolicznym (ang. off-axis parabolic mirror, OAP) jako elementem ogniskującym. Gdy światło podczerwone jest kierowane przez górny obiektyw, rozchodzi się ono wraz z wiązką widzialną. Obie wiązki są ułożone współliniowo (co-prop) i oświetlają próbkę z tej samej strony, w tym samym miejscu. W tej konfiguracji do pomiarów można używać tylko obiektywu refleksyjny Cassegrain.

Gdy promieniowanie podczerwone jest kierowane przez układ OAP, dociera do próbki w konfiguracji przeciwbieżnej (counter-prop), tj. z kierunku przeciwnego do światła widzialnego. W tej konfiguracji do pomiarów można użyć dowolnego obiektywu górnego, jednak ze względu na lepsze parametry optyczne preferowane są obiektywy refrakcyjne 50x lub 60x.

Grafika 2. Konfiguracja mikroskopu O-PTIR

W systemie O-PTIR światło podczerwone nie jest bezpośrednio wykrywane przez żadne detektory. Mikroskop jest wyposażony w dwa detektory światła widzialnego. Jedna fotodioda jest przystosowana do wykrywania promieniowania rozproszonego lub odbitego od próbki przez obiektyw górny. W tej konfiguracji dostępna jest także fotodioda lawinową (ang. avalanche photodiode, APD), która jest wykorzystywana tylko w przypadku bardzo niskich mocy lasera widzialnego w przypadku eksperymentów z próbkami foto- i termicznie wrażliwymi. Druga fotodioda służy do detekcji światła przechodzącego przez próbkę. Jest ona stosowana w przypadku próbek zbyt cienkich i o niskim współczynniku odbicia.

Nowa metoda detekcji widma IR może być stosowana w przypadku próbek o silnej reakcji fluorescencyjnej. W metodzie szerokokątnej obrazowanie fluorescencyjne służy do detekcji absorpcji podczerwieni z pewnego obszaru próbki. W eksperymencie wykorzystywana jest konfiguracja counter-prop. OAP jest ustawiony w taki sposób, aby wiązka IR była rozogniskowania, tj. aby oświetlało pewien obszar próbki, a nie skupiało się na pojedynczym punkcie. Pomiary przeprowadza się poprzez pomiar sekwencji obrazów fluorescencyjnych z i bez światła podczerwonego padającego na próbkę. Porównując te obrazy możliwy jest pomiar ponad 260 tysięcy widm IR jednocześnie z rozdzielczością 8 cm^-1 w czasie poniżej godziny.

Przygotowanie próbki do pomiarów

Pomiary w konfiguracji co-prop nie wymagają żadnego przygotowania próbki. Metoda nie ma wymagań dotyczących grubości próbki ani stosowania żadnych specyficznych podłoży, zwłaszcza jeśli planuje się pomiary tylko pojedynczych widm z wybranych punktów na próbce. Pomiary nie wymagają kontaktu między obiektywem a próbką, poprawnie zoptymalizowane są nieniszczące. W przypadku próbek o nieregularnej powierzchni, obrazowanie może być wykonane jedynie do niewielkich obszarów. W przypadku próbek wrażliwych na światło lub ciepło możliwe jest przeprowadzenie pomiarów przy niskiej mocy lasera z wykorzystaniem fotodiody lawinowej.

Pomiary w konfiguracji counter-prop wymagają:

• Grubości próbki poniżej 10 µm
• Podłoża z fluorku wapnia o średnicy 10 mm i grubości 0,35 mm

Szkiełka mikroskopowe o tych wymiarach pasują do uchwytu dostosowanego do stolika pomiarowego w mikroskopie i umożliwiają szybkie rozpoczęcie eksperymentów. Inne podłoża przepuszczalne dla podczerwieni o średnicy do 2 cm i grubości do 1 mm także nadają się do pomiarów, jednak jakość uzyskanych widm będzie niższa. Wymagania dotyczące pomiarów w trybie widefield są identyczne jak w przypadku metody counter-prop, konieczna jest jednak obecność silnej autofluorescencji same próbki lub fluorescencji barwników w próbce. Do pomiarów O-PTIR w środowisku wodnym mikroskop jest wyposażony w obiektyw zanurzeniowy o powiększeniu 60x. Wymagania są analogiczne jak w przypadku trybu counter-prop.