Przejdź do głównej treści
Wersja kontrastowa
en English Menu

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Cryo-EM

Nawigacja okruszkowa Nawigacja okruszkowa

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Metody eksperymentalne

Kriomikroskopia SOLARIS (Cryo-EM Facility) oferuje przygotowanie próbek do badań kriomikroskopowych (witryfikacja), wstępną charakterystykę próbek (ang. sample screening) oraz zbieranie zestawów danych w ramach dostępnych technik badawczych: analizy pojedynczych cząstek (SPA), kriotomografii elektronowej (cET) i dyfrakcji elektronowej na mikrokryształach (MicroED).
Dodatkowo wspieramy naukowców i użytkowników przemysłowych w analizie danych eksperymentalnych zebranych w naszej pracowni.

Opis dostępnych technik badawczych kriomikroskopii elektronowej (Thermo Fisher Scientific)

Przed i po eksperymencie – ważne informacje

  • Aby uniknąć ewentualnych opóźnień eksperymentu i w pełni wykorzystać przyznany czas badawczy na kriomikroskopie Krios G3i, użytkownicy proszeni są o przekazanie opisanych próbek gotowych do pomiarów (zamrożonych na siatkach TEM i wstępnie scharakteryzowanych) na co najmniej tydzień przed zaplanowaną sesją pomiarową.
  • Przeszkoleni użytkownicy mogą samodzielnie prowadzić badania wstępne przy użyciu mikroskopu Glacios pod nadzorem opiekuna infrastruktury.
  • Zebrane dane eksperymentalne przechowywane będą przez 30 dni od zakończenia eksperymentu. Po tym okresie mogą zostać usunięte bez uprzedniego powiadomienia użytkownika.
  • Przebadane próbki zachowane zostaną na okres 6 miesięcy od zakończenia eksperymentu. Po tym czasie mogą zostać usunięte bez uprzedniego powiadomienia użytkownika.
  • Oferujemy konsultacje i wsparcie dla działań użytkowników w ramach eksperymentów kriomiorskopowych.
  • Kriomikroskop Glacios (200 kV): 1 zmiana (shift) trwa 24 godz., z czego 8 godzin przeznaczamy na badania wstępne, a 16 godzin na zbieranie zestawów danych. Detektor Falcon 4 umożliwia rejestrację ~450 filmów/godz., co przekłada się na blisko 7000 filmów w ciągu zmiany (ok. 4,2 TB danych).
  • Kriomikroskop Krios G3i (300 kV): 1 zmiana (shift) trwa 60 godz., z czego 55 godzin przeznaczamy na zbieranie danych. Detektor K3 umożliwia rejestrację ~680 filmów/godz., co przekłada się na blisko 40000 filmów w ciągu zmiany (~16 TB danych).
  • Aby usprawnić proces kopiowania danych zalecamy dostarczenie przenośnego dysku 3,5” (ze stacją dokującą) w celu kopiowania danych „w locie”. Możliwe jest także skopiowanie danych użytkownika na zewnętrzne serwery danych.
  • Analizę zebranych danych można przeprowadzić korzystając z superkomputera Athena zlokalizowanego w ACK Cyfronet AGH.

Metodologia

Metodologia prac badawczych w technice kriomikroskopii elektronowej obejmuje 5 etapów przedstawionych na poniższym schemacie (rys. 1.). Cały proces rozpoczyna preparatyka i oczyszczanie próbki ze wstępną charakterystyką biochemiczną. Następnie próbka poddawana jest witryfikacji na siatkach mikroskopowych oraz badaniom wstępnym na kriomikroskopie w celu oceny jej jakości, grubości lodu oraz dystrybucji cząsteczek w nim zawartych. Dla optymalnych próbek, zbierany jest właściwy zestaw danych, służący rozwiązaniu struktury przestrzennej badanej próbki.

Rys.1. Od biochemii do struktury przestrzennej makromolekuł – kolejne kroki badawcze w technice kriomikroskopii elektronowej.

Rys.1. Od biochemii do struktury przestrzennej makromolekuł – kolejne kroki badawcze w technice kriomikroskopii elektronowej.

Preparatyka materiału biologicznego

Dla powodzenia badań kriomikroskopowych i określenia struktury przestrzennej badanej cząsteczki kluczowe znaczenie ma jakość próbki. Próbki do badań kriomikroskopowych powinny charakteryzować się wysoką czystością, stabilnością oraz homogennością konformacyjną. Należy również zwrócić uwagę na odpowiedni dobór buforu stabilizującego próbkę, bez zbędnych dodatków, które mogą wpływać na kontrast obrazu (np. glicerolu).

Preparatykę próbki można przeprowadzić korzystając ze standardowych metod oczyszczania białek rekombinowanych, takich jak np. różnego rodzaju chromatografie (powinowactwa, jonowymienna) oraz sączenie molekularne (ang. size exclusion chromatography, SEC).  Czystość preparatu można ocenić przy pomocy elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE), a homogenność próbki przy pomocy układu SEC–MALS (wielokątowe rozpraszanie światła, ang. multi angle light scattering) lub dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

Przykładowa analiza biochemiczna wyizolowanych i oczyszczonych białek została przedstawiona na rys. 2. Dalsze analizy, w tym aktywność enzymatyczna, spektroskopia optyczna i analiza elektroforetyczna wykazały, że badana frakcja próbki zawierała pełny zestaw podjednostek Cyt b6f i była aktywna enzymatycznie, stąd została rekomendowana do badań kriomikroskopowych. (Sarewicz et al., doi:10.1126/sciadv.add9688).

Rys. 2. Żel SDS–PAGE obrazujący czystość próbki kompleksu Cyt b6f zobrazowanego w kriomikroskopie. Żel wybarwiono barwnikiem Coomassie Briliant Blue. Każdemu prążkowi odpowiada białko o określonej masie molekularnej.

Rys. 2. Żel SDS–PAGE obrazujący czystość próbki kompleksu Cyt b6f zobrazowanego w kriomikroskopie. Żel wybarwiono barwnikiem Coomassie Briliant Blue. Każdemu prążkowi odpowiada białko o określonej masie molekularnej. Sarewicz et al., doi:10.1126/sciadv.add9688 

Preparatyka próbek kriomikroskopowych Cryo-EM

Przygotowanie preparatu kriomikroskopowego rozpoczyna się od aktywacji powierzchni siatki mikroskopowej przy pomocy plazmy. Następnie na siatkę nanosi się próbkę w celu jej zamrożenia. Podczas mrożenia nie można dopuścić do utworzenia się krystalicznego lodu, aby zachować natywną strukturę próbki. Uzyskuje się to poprzez szybkie zanurzenie siatki z próbką w ciekłym etanie. Proces ten wykonuje się w urządzeniu zwanym Vitrobotem, którego parametry pracy można dostosować w zależności od potrzeb. Należy dążyć do tego, aby cząsteczki tak zamrożonej próbki charakteryzowały się równomiernym zagęszczeniem oraz losową orientacją w amorficznym lodzie.
 
Pracownia Kriomikroskopii SOLARIS dysponuje następującym oprzyrządowaniem do przygotowania próbek kriomikroskopowych:
  • napylarka próżniowa (Safematic CCU-010 Compact Coating Unit) - urządzenie to wykorzystuje się do przygotowania powierzchni komercyjnych siatek mikroskopowych poprzez ich aktywację w niskoenergetycznej plazmie, tworzonej przez wyładowanie jarzeniowe w rozrzedzonym gazie. Zwiększona hydrofilowość folii węglowej (polimerowej) siatki TEM poprawia zwilżalność jej powierzchni, a co za tym idzie pomaga zoptymalizować rozkład cząsteczek w lodzie. Oddziaływaniem plazmy na powierzchnię siatek można sterować poprzez odpowiednie ustawienie: wysokości stolika z siatkami względem katody, prądu wyładowania i czasu ekspozycji. Napylarkę można również wykorzystać do napylania nanometrycznych warstw amorficznego węgla.
  • robot do witryfikacji próbek kriomikroskopowych (Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific). Kropla buforu z próbką umieszczana jest na siatce mikroskopowej, jej nadmiar jest odciągany przez papier filtracyjny, po czym preparat zostaje z dużą szybkością, zanurzony w ciekłym etanie, co prowadzi do uwięzienia cząsteczek próbki w amorficznym lodzie. Proces mrożenia przebiega w komorze środowiskowej i jest sterowany poprzez graficzny interfejs użytkownika, co zapewnia większą jego powtarzalność. Procesem mrożenia można sterować poprzez odpowiednie ustawienie programu witryfikacji tj. dostosowania parametrów m.in.: względnej wilgotności komory (do 100%), temperatury komory (4-60 °C), czasu i siły odciągania buforu z próbką, a także czasu inkubacji próbki na siatce przed zamrożeniem.
Protokoły przygotowania siatek z wykorzystaniem wyładowania jarzeniowego oraz protokoły witryfikacji próbek są dostępne przy stanowiskach badawczych. Równocześnie użytkownicy Kriomikroskopii SOLARIS mogą liczyć na konsultacje i wsparcie doświadczonej kadry przy preparatyce próbek.

Próbka

Zwykle próbki kriomikroskopowe przygotowywane są przy użyciu 2-3 μl roztworu białka o stężeniu 50 nM - 5 μM., w zależności od rodzaju białka, rodzaju roztworu wodnego, rozmiaru cząsteczek, warunków stosowanych do witryfikacji czy typu siatek TEM. Optymalne stężenie zwykle dobiera się empirycznie.
Użycie kompleksów białkowych przygotowanych „na świeżo” może poprawić jakość zamrażanej próbki: integralność, stabilność i redystrybucję cząsteczek, w szczególności jeśli próbka ma tendencję do tworzenia agregatów lub dekompozycji.
 
Oprócz jednorodności próbki ważne jest, aby cząstki na siatce mikroskopowej były w optymalnym stężeniu, równomiernie rozmieszczone i losowo zorientowane, tak aby do rekonstrukcji struktury dostępne były rzuty ze wszystkich kierunków. W przypadku próbek wykazujących preferencyjną orientację cząstek lub jeśli widoczna jest denaturacja białek na granicy faz powietrze-woda, te niekorzystne efekty można ograniczać poprzez:
  • zastosowanie siatek pokrytych ultracienką warstwą tlenku grafenu - wiele biomolekuł ma silne powinowactwo do węgla, przez co można polepszyć ich dyspersję czy dodatkowo je zagęścić w lodzie,
  • dodatek detergentów w buforze - obniża napięcie powierzchniowe,
  • dostosowanie metody zbierania danych, tak by obejmowała również nachylone ekspozycje próbek.

Siatki mikroskopowe

W zależności od potrzeb projektu użytkownika, optymalną siatkę można dobrać z szerokiej gamy komercyjnie dostępnych siatek mikroskopowych (typ materiału z którego wykonano siatki TEM, kształt i wielkość otworów siatki (tzw. mesh), typ pokrycia siatki (np. formvar, tlenek grafenu, węgiel amorficzny, …), rodzaj pokrycia siatki czy wielkości otworów folii nośnej (np. quantifoil, lacey, holy, continuous, …) itd. 

Z technicznego punktu widzenia zbierania zestawów danych kriomikroskopowych oraz ich późniejszej analizy, folia wspierająca próbki powinna zapewniać zarówno wysoką stabilność dla próbki, jak i niski poziom sygnału tła. Ponadto geometria otworów w folii powinna być optymalna dla danej metody eksperymentalnej, tak aby uzyskać wysoką przepustowość eksperymentu i zebrać możliwie jak najwięcej danych w jak najkrótszym czasie. 
Przykładowo dla techniki SPA białek i kompleksów białkowych optymalna byłaby siatka Cu 200 mesh z pokryciem typu quantifoil o geometri R2/1 czyli układu okrągłych otworów o średnicy 2 µm i odległości pomiędzy otworami równej 1µm. Niewiele mniejszą szybkość zbierania danych uzyskuje się też dla siatek R1.2/1.3. Na ogół próbka o większych wymiarach zwłaszcza w przypadku całych komórek czy bakterii, będzie wymagała większych rozmiarów otworów w pokryciu siatki (np. lacey carbon) i ewentualnie dodatkowego wsparcia (quantifoli, holey carbon), Tam gdzie stosuje się technikę kriotomografii elektronowej, czy przy badaniach próbek wymagających pochyłu siatki w trakcie zbierania danych, często dobiera się siatki o większych otworach (np. siatka Cu 100 mesh), co pozwala zachować stałe pole widzenia przy większych kątach pochyłu.

Transfer siatek z próbkami

Do przenoszenia zamrożonych preparatów na siatkach mikroskopowych używamy opatentowanych uchwytów tzw. AutoGrids i kompatybilnych narzędzi (Thermo Fisher Scientific). Zastosowane uchwyty umożliwiają wymianę próbek pomiędzy mikroskopami oraz ich bezpieczne przechowywanie (Rys. 3).

Rys. 3. Przygotowanie próbek do badań kriomikroskopowych: klipowanie siatki z próbkami użytkowników (a), przekładanie ich do kasety (b), a następnie umieszczanie kasety z próbkami w zautomatyzowanym podajniku (ang. autoloader) kriomikroskopu Krios G3i (c). Kadr z video: CiekaWizja Wiktor Niedzicki – Synchrotron SOLARIS

Rys. 3. Przygotowanie próbek do badań kriomikroskopowych: klipowanie siatki z próbkami użytkowników (a), przekładanie ich do kasety (b), a następnie umieszczanie kasety z próbkami w zautomatyzowanym podajniku (ang. autoloader) kriomikroskopu Krios G3i (c). Kadr z video: CiekaWizja Wiktor Niedzicki – Synchrotron SOLARIS.

Optymalizacja próbek

Zwitryfikowane próbki poddawane są badaniom wstępnym (ang. sample screening) przy wykorzystaniu kriomikroskopu elektronowego (Glacios), w celu oceny następujących parametrów:
  • jakość, grubość i jednorodność lodu na siatce mikroskopowej,
  • stężenie, integralność, stabilność i dystrybucja cząsteczek próbki w lodzie (czy cząsteczki ulegają agregacji lub dekompozycji).
Informacje uzyskane w badaniach wstępnych wykorzystywane są w procesie optymalizacji przygotowania próbki oraz zamrażania siatek, tak aby były one jakościowo odpowiednie do dalszych (wysokorozdzielczych) badań.
Podczas badań wstępnych każda siatka jest analizowana w kolejnych powiększeniach:
  • 155x  – jakościowy przegląd oczek siatki mikroskopowej pod kątem gradientu grubości lodu,
  • 700x – wybranie oczka siatki z optymalną grubością lodu, 
  • 13 500x – jakościowa ocena lodu z cząsteczkami w otworach folii polimerowej,
  • 190 000x – obrazowanie cząstek docelowych zawieszonych w lodzie. 
Przykładowe zdjęcia wykonane na mikroskopie Glacios za pomocą oprogramowania do zbierania danych EPU (Thermo Fisher Scientific) z wykorzystaniem bezpośredniego detektora elektronów Falcon 4 przedstawiono na rys.4. 
Fig. 4. Przykładowe zdjęcia cząsteczek apoferrytyny zebrane za pomocą oprogramowania EPU z wykorzystaniem bezpośredniego detektora elektronów Falcon 4 na mikroskopie Glacios.
Rys. 4. Przykładowe zdjęcia cząsteczek apoferrytyny zebrane za pomocą oprogramowania EPU z wykorzystaniem bezpośredniego detektora elektronów Falcon 4 na mikroskopie Glacios.  
 
Analiza wstępnego zestawu danych, tj. wybranie cząsteczek i ich klasyfikacja 2D może udzielić informacji o czystości próbki w skali mikroskopowej - wyizolowane i oczyszczone biomolekuły natywnych kompleksów mogą składać się z mieszaniny strukturalnie różnych konformacji lub składowo różnych podkompleksów. Natomiast pełna analiza danych pozwoli uzyskać wstępną mapę gęstości potencjału, która powinna umożliwić wpasowanie się poszczególnych białek i ich domen (rys. 5).
Rys. 5. Wybrane 21 000 cząsteczek Cyt b6f (220kDa) posortowane i uśrednione w klasach 2D (po lewej) oraz wstępna rekonstrukcja trójwymiarowej struktury cząsteczki Cyt b6f w rozdzielczości 4,5 Å (po prawej), wraz z dopasowaniem modelu wstęgowego struktury drugorzędowej (multikolor) do mapy gęstości potencjału krio-EM (szary). Wokół kompleksu Cyt b6f widoczna jest lipidowa otoczka.
Rys. 5. Wybrane 21 000 cząsteczek Cyt b6f (220kDa) posortowane i uśrednione w klasach 2D (po lewej) oraz wstępna rekonstrukcja trójwymiarowej struktury cząsteczki Cyt b6f w rozdzielczości 4,5 Å (po prawej), wraz z dopasowaniem modelu wstęgowego struktury drugorzędowej (multikolor) do mapy gęstości potencjału krio-EM (szary). Wokół kompleksu Cyt b6f widoczna jest lipidowa otoczka. (prof. A. Osyczka, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, Kraków, Polska). 
 

W wyniku analizy danych zarejestrowanych metodami cryo-EM uzyskuje się tzw. mapy potencjału lub mapy gęstości. Ten obiegowy skrót myślowy oznacza dane objętościowe zawierające zmierzony potencjał Coulombowski elektronów wiązki rozpraszanych na atomach próbki, jako reprezentację badanej cząsteczki. Interpretacja zwykle obejmuje inspekcję izopowierzchni zrekonstruowanej mapy za pomocą oprogramowania do wizualizacji, a następnie ręczne lub automatyczne opisywanie jej cech za pomocą współrzędnych atomowych i późniejsze udokładnianie modelu. 

Z danych SPA rejestrowanych na mikroskopie Glacios użytkownicy rutynowo określają trójwymiarowe struktury makrocząsteczek w rozdzielczościach z przedziału 4-8 Å dla małych cząstek (<200 kDa) oraz poniżej 4 Å dla cząstek średnich i dużych (≥400 kDa).

Strategia zbierania danych przy użyciu kriomikroskopów

Docelowe zestawy danych zbierane są dla wybranych próbek o odpowiedniej jakości. Sesję pomiarową dla każdej próbki rozpoczyna zebranie tzw. Atlasu, czyli poglądowe zobrazowanie całej siatki mikroskopowej, w celu oceny jakości i grubości lodu. Z dostępnych miejsc na próbce tzw. oczek siatki (eng. grid squares), wybierane są te optymalne. Następnie, w obrębie kolejnych oczek siatki zaznaczane są otwory folii (eng. foil holes) pokryte lodem. Kolejno, na docelowych obszarach próbki (eng. exposure), w otworach folii gdzie widoczne są cząsteczki, ustalany jest schemat zbierania obrazów o wysokiej rozdzielczości przy możliwie najwyższej przepustowości.
 
  • Kriomikroskop Glacios (200 kV): 1 zmiana (shift) trwa 24 godz., z czego 8 godzin przeznaczamy na badania wstępne, a 16 godzin na zbieranie zestawów danych. Detektor Falcon 4 umożliwia rejestrację ~450 filmów/godz., co przekłada się na blisko 7000 filmów w ciągu zmiany (ok. 4,2 TB danych). Z danych SPA rejestrowanych na mikroskopie Glacios użytkownicy rutynowo określają struktury przestrzenne makrocząsteczek w rozdzielczościach z przedziału 4-8 Å dla cząstek małych (<200 kDa) oraz poniżej 4 Å dla cząstek średnich i dużych (≥400 kDa).
  • Kriomikroskop Krios G3i (300 kV): 1 zmiana (shift) trwa 60 godz., z czego 55 godzin przeznaczamy na zbieranie danych. Detektor K3 umożliwia rejestrację ~680 filmów/godz., co przekłada się na blisko 40000 filmów w ciągu zmiany (~16 TB danych). Z danych SPA rejestrowanych na mikroskopie Krios G3i użytkownicy rutynowo określają struktury przestrzenne makrocząsteczek w rozdzielczościach z przedziału 2-4 Å (aktualny rekord 1,93 Å). 
Tabela 1. Standardowe parametry zbierania danych metodami SPA i cET dla mikroskopów krioelektronowych Glacios i Krios G3i (przy użyciu oprogramowania do zbierania danych Thermo Fisher Scientific: EPU i Tomography). Ustawienia mikroskopu i parametry zbierania danych mogą się różnić w zależności od indywidualnych wymagań eksperymentu użytkownika.
 
Analiza Pojedynczych Cząstek (SPA) 
Mikroskop Krios G3i Glacios
Napięcie przyspieszające 300 kV 200 kV
Całkowita dawka mierzona bez próbki 40 e/A2  40 e/A2 
Rozmiar piksela [A/px]  0.846 A/px 0.73 A/px 
Aberracja sferyczna 2.7 mm 2.7 mm
Liczba ramek na film 40 40 or EER fractions 
Typ danych TIFF/MRC  EER/MRC 
Powiększenie  105 000x  190 000x 
Wartości rozogniskowania  -1.8, -1.5, -1.2, -0.9, -0.6 µm -2.0, -1.5, -1.0 µm
Ekspozycje na oczko folii 6-8 (/2µm) 1-4 (/2µm)
Filtr energii Gatan BioQuantum-slit 20eV N/A
Detektor Gatan K3  TFS Falcon 4
Tryb pracy kamery counting mode counting mode
Szybkość zliczeń detektora 15-16 e/px/s  6-8 e/px/s 
Rozdzielczość obrazu 5760 x 4092 4096 x 4096 
Typ filmu .tiff gain corrected .eer gain not corrected 
 
Kriotomografia elektronowa (cET)
Mikroskop Krios G3i Glacios
Napięcie przyspieszające 300 kV 200 kV
Aberracja sferyczna 2.7 mm  2.7 mm 
Rozmiar piksela .mrc  1.69 A/px 4.00 A/px 
Rozmiar piksela .tiff 0.846 A/px -
Rozmiar piksela .eer N/A 2.00 A/px 
Całkowita dawka mierzona bez próbki 100-150 e/A2 100-150 e/A2 
Liczba ramek na film 10 frakcje EER 
Strategia zbierania danych dose symmetric dose symmetric
Zakres serii kątowej (51 filmów) -50 to +50 deg, step = 2 deg  -50 to +50 deg, step = 2 deg
Stałe rozogniskowanie -5 um -7 um
Powiększenie 53 000x 36 000x 
Apertura C2  50 um 150 um
Detektor Gatan K3 TFS Falcon 4
Tryb pracy kamery counting super resolution  counting mode
Szybkość zliczeń detektora 15-16 e/px/s  6-8 e/px/s 
Rozdzielczość obrazu 5760 x 4092 4096 x 4096 
Typ filmu .tiff gain corrected  .eer gain not corrected 
Filtr energii Gatan BioQuantum - slit 40eV  N/A
 
Podczas zbierania danych SPA  (Glacios/Krios G3i) możliwe jest przetwarzanie w locie losowych partii zebranych filmów, np. korekcja wzmocnienia, korekcja ruchu, oszacowanie CTF (funkcji transferu kontrastu) czy wstępne wybieranie cząsteczek (rys. 6). Tego typu analiza może posłużyć do monitorowania procesu akwizycji, wstępnej oceny jakości zbieranych danych i ewentualnej korekcji ustawień i parametrów eksperymentu. Standardowo monitorujemy wskaźniki związane ze wstępnym przetwarzaniem obrazu, m.in. sprawdzamy czy ustawione parametry rozogniskowania odpowiadają tym zmierzonym, monitorujemy poziom astygmatyzmu obrazu oraz zakres ruchu próbki wywołany wiązką elektronów.
Przykładowy obraz po korekcji ruchu uzyskany dla kompleksu Cyt b6f, cząsteczki (220 kDa) zaznaczone żółtymi okręgami zostały wybrane automatycznie przez trenowane sieci neuronowe, maska zaznaczona kolorem fioletowym. Oprogramowanie WARP, obraz zebrany na kriomikroskopie Krios G3i na detektorze K3.
Rys. 6. Przykładowy obraz po korekcji ruchu uzyskany dla kompleksu Cyt b6f, cząsteczki (220 kDa) zaznaczone żółtymi okręgami zostały wybrane automatycznie przez trenowane sieci neuronowe, maska zaznaczona kolorem fioletowym. Oprogramowanie WARP, obraz zebrany na kriomikroskopie Krios G3i na detektorze K3.

Rekonstrukcja i wizualizacja struktury w 3D

Struktura makrocząsteczki w trzech wymiarach jest wstępnie rekonstruowana (ab-initio) z tysięcy mikrografii przedstawiających setki dwuwymiarowych projekcji poszczególnych cząsteczek w losowych orientacjach. Jednak, aby usprawnić proces określania struktury przestrzennej i uzyskać wysokorozdzielczą rekonstrukcję 3D cząsteczki, molekuły badanej próbki powinny być strukturalnie jednorodne tzn. wykazywać jedynie ograniczoną heterogeniczność strukturalną.
 
Zestawy danych SPA zebrane przy użyciu mikroskopu Krios G3i mogą być w pełni przetwarzane w locie przy użyciu oprogramowania CryoSPARC Live. Dzięki temu możemy monitorować i oceniać jakość zbieranych danych kriomikroskopowych w czasie rzeczywistym, jak również wstępnie przeprocesować filmy, wybrać i sklasyfikować cząstki oraz uzyskać wstępną rekonstrukcję struktury przestrzennej 3D (ab-initio) cząsteczki w trakcie trwania eksperymentu. Proces budowania się i udokładniania trójwymiarowych map gęstości wraz z napływem kolejnych danych, można bezpośrednio śledzić i łączyć ze strukturalnymi cechami cząsteczki (modelem).
 
Istnieje szereg pakietów oprogramowania opracowywanych na przestrzeni ostatnich lat, wspomagających  przetwarzanie danych kriomikroskopowych (instrukcje i oprogramowanie).
Metodologię przetwarzania zestawów danych kriomikroskopowych przedstawiono na rys.7, na przykładzie kompleksu cytochromu Cyt b6f (grupa białek uczestnicząca w transporcie elektronów w procesie fotosyntezy, 220kDa) oraz Cyt b6f – PC (kompleksu cytochromu z plastocyjaniną, białkiem 10.5 kDa), gdzie wykorzystano oprogramowania: cryoSPARC i RELION.
  • Analizę zebranych zestawów danych można przeprowadzić korzystając z zasobów superkomputerów Cyfronetu (Athena).

Rys. 7. Metodologia przetwarzania zestawów danych kriomikroskopowych dla kompleksów Cyt b6f – PC i Cyt b6f.

Rys. 7. Metodologia przetwarzania zestawów danych kriomikroskopowych dla kompleksów Cyt b6f – PC i Cyt b6f. (a) Reprezentatywne obrazy kriomikroskopowe, (b) kolejne kroki przetwarzania zestawu danych Cryo_EM, (c) korelacja powłok Fouriera (FSC). Niebieskie linie wskazują FSC=0,143 z zaznaczonymi odcięciami rozdzielczości rekonstrukcji, (d) gęstość rdzenia białkowego zaznaczona kolorem zielonym (wyostrzona mapa) oraz nałożona z półprzeźroczystą gęstością odpowiadającą powłoce lipidowej (wyostrzona mapa wygładzona gaussowsko). Wszystkie mapy konturowane do poziomu RMS 5, (e) zakres rozdzielczości wszystkich map na poziomie RMS 5, z plastocyjaniną konturowaną do poziomu RMS 3 dla mapy z RELIONa, (f) rozkład kątowy Eulera cząstek Cyt b6f – PC dający wkład do ostatecznej rekonstrukcji w RELIONie i rozkład kątowy cząstek obliczony w CryoSPARCu dla mapy Cyt b6f. Mapa temperaturowa przedstawia liczbę cząstek dla każdego kąta obserwacji, (g) wybrane uśrednione klasy 2D cząstek wchodzących do rekonstrukcji map Cyt b6f – PC i Cyt b6f w RELIONie. (Sarewicz et al.,  doi:10.1126/sciadv.add9688) 

Infrastruktura IT: przechowywanie, transfer i procesowanie danych pomiarowych

Duże ilości danych generowanych w eksperymentach kriomikroskopowych (nawet 16 TB/ 1 zmianę) muszą być odpowiednio przechowywane, kopiowane i przetwarzane. 
Zebrane dane eksperymentalne są przechowywane na serwerach SOLARIS przez 30 dni od daty zakończenia eksperymentu. Po tym okresie dane są usuwane bez uprzedniego powiadomienia użytkownika. 
  • Obecnie dostępna przestrzeń dyskowa na serwerach SOLARIS to 231 TB dla danych z kriomikroskopu Krios G3i oraz 1,4 PB dla danych z mikroskopu Glacios. Przestrzeń dyskowa kriomikroskopu Glacios oparta jest na rozwiązaniu Dell PowerScale, zapewniającym bezpieczeństwo gromadzonych danych, przy jednoczesnej ergonomii administracji.
  • Na potrzeby obliczeń i analizy danych kriomikroskopowych zakupiony został serwer obliczeniowy wyposażony w dwa CPU (łącznie 72 wątki), kartę graficzną Tesla V100 z 32 GB pamięci, co znacznie przyspiesza obliczenia.  System wspomagany jest przez 750 GB pamięci RAM.
  • Dla użytkowników dostępne są 3 stacje robocze GPU do wstępnego przetwarzania danych kriomikroskopowych.
  • Transmisja danych pomiędzy podsystemami odbywa się po łączu o przepustowości 10 Gbps.
Aby usprawnić proces kopiowania danych zalecamy zabranie przenośnego dysku 3,5” (ze stacją dokującą) aby kopiować dane w locie. Inną opcją jest skopiowanie danych użytkownika bezpośrednio na zewnętrzne serwery danych. 
Analizę zebranych zestawów danych można przeprowadzić korzystając z zasobów superkomputerów Cyfronetu (Ares, Athena).

Przechowywanie próbek

Kriomikroskopia SOLARIS oferuje przygotowanie próbek do badań kriomikroskopowych (witryfikacja) na miejscu. Przygotowanie próbek możliwe jest również w pobliskim MCB w Specjalistycznym Laboratorium Biologii Strukturalnej (SBCF Core Facility).
Próbki przygotowane wcześniej, jak również próbki do zamrożenia, można przesyłać na adres SOLARIS po wcześniejszych ustaleniach z zespołem badawczym.
  • Aby uniknąć ewentualnych opóźnień eksperymentu i w pełni wykorzystać przyznany czas badawczy użytkownicy proszeni są o przekazanie próbek gotowych do pomiarów (zamrożonych na siatkach TEM oraz dobrze opisanych) na co najmniej tydzień przed zaplanowaną sesją kriomikroskopową.
  • Użytkownicy mogą korzystać z systemów do magazynowania gotowych preparatów dostępnych w SOLARIS.
  • Przebadane próbki są przechowywane do 6 miesięcy od daty zakończenia eksperymentu. Po tym okresie próbki są usuwane bez uprzedniego powiadomienia użytkownika.